AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]

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美國(guó)AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學(xué)研究、診斷研發(fā)及藥物開發(fā)的科學(xué)家研發(fā)、生產(chǎn)和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，包括吸收（顏色），熒光和發(fā)光技術(shù)。AAT Bioquest的產(chǎn)品幫助quan世界的科學(xué)家和生物醫(yī)藥研究者更好的了解生物化學(xué)，免疫學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AAT Bioquest會(huì)不斷介紹新產(chǎn)品，快速的豐富各個(gè)領(lǐng)域的產(chǎn)品。

 AAT Bioquest qing化物5.5馬來(lái)酰亞胺

AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]，產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

產(chǎn)品品牌：AAT Bioquest

產(chǎn)品貨號(hào)：175

產(chǎn)品名稱：qing化物5.5馬來(lái)酰亞胺[相當(dāng)于Cy5.5®馬來(lái)酰亞胺]

英文名稱：AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]

產(chǎn)品規(guī)格：1 mg

產(chǎn)品說(shuō)明：

多種花青 5.5 （Cy5.5®） 染料已被用于標(biāo)記生物分子，用于熒光成像和其他基于熒光的生化分析。它們廣泛用于標(biāo)記肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸等。Cy5.5®染料是最常見(jiàn)的紅色熒光團(tuán)之一。Cy5.5®馬來(lái)酰亞胺容易與硫醇基團(tuán)反應(yīng)。Cy5.5®是GE Healthcare的商標(biāo)。

示例協(xié)議

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.花青5.5馬來(lái)酰亞胺儲(chǔ)備液（溶液B）

將無(wú)水DMSO加入花青5.5馬來(lái)酰亞胺小瓶中，制成10mM儲(chǔ)備溶液。通過(guò)移液或渦旋充分混合。注意：在開始偶聯(lián)之前制備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）。請(qǐng)及時(shí)使用。延長(zhǎng)染料儲(chǔ)備溶液的儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情況下可在冰箱中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá) 4 周。避免凍融循環(huán)。

2.蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液（溶液A）

將 100 μL 反應(yīng)緩沖液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 緩沖液）與 900 μL 目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體、蛋白濃度>如果可能，為 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白標(biāo)記儲(chǔ)備液。注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為6.5±0.5。注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白 （BSA） 或其他蛋白質(zhì)穩(wěn)定的抗體將不能很好地標(biāo)記。注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，則偶聯(lián)效率顯著降低。為獲得最佳標(biāo)記效率，建議最終蛋白濃度范圍為 2-10 mg/mL。

3. 可選

如果您的蛋白質(zhì)不含游離半胱an酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理您的蛋白質(zhì)以生成硫醇基團(tuán)。DTT 或 TCEP 用于將二硫鍵轉(zhuǎn)化為兩個(gè)游離硫醇基團(tuán)。如果使用 DTT，則必須在將染料馬來(lái)酰亞胺與蛋白質(zhì)偶聯(lián)之前，通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾去除游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團(tuán)的示例方案：

1. 在蒸餾水中制備1M DTT（15.4mg / 100μL）的新鮮溶液。

2. 在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時(shí)每 ml IgG 溶液中加入 20 μL DTT 原液。在室溫下靜置 30 分鐘，無(wú)需額外混合（以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸）。

3. 將還原的IgG通過(guò)用“交換緩沖液"預(yù)先平衡的過(guò)濾柱。從色譜柱上收集 0.25 mL 餾分。

4. 確定蛋白質(zhì)濃度并將餾分與大部分 IgG 合并。這可以通過(guò)分光光度法或比色法完成。

5. 在此步驟之后盡快進(jìn)行偶聯(lián)（參見(jiàn)樣品實(shí)驗(yàn)方案）。注意：IgG 溶液應(yīng)為 >4 mg/mL，以獲得最佳效果。如果抗體低于 2 mg/mL，則應(yīng)濃縮抗體。在緩沖液交換柱上額外增加 10% 的損失。注意：還原可以在pH 7-7.5的幾乎任何緩沖液中進(jìn)行，例如MES、磷酸鹽或TRIS緩沖液。注意：步驟 3 和 4 可以用透析代替。

實(shí)驗(yàn)方案樣本

該標(biāo)記方案是為山羊抗小鼠 IgG 與花青 5.5 馬來(lái)酰亞胺的偶聯(lián)物而開發(fā)的。您可能需要針對(duì)您的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而染料/蛋白質(zhì)比率低的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物會(huì)降低靈敏度。

運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)

以溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比為10：1的摩爾比作為起點(diǎn)：將5μL染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10mM）加入蛋白質(zhì)溶液（95μL溶液A）的小瓶中，有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL，蛋白質(zhì)的分子量為 ~200KD，則蛋白質(zhì)的濃度為 ~0.05 mM。 注意：我們建議使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）的摩爾比為 10：1。如果太少或太高，則分別確定 5：1、15：1 和 20：1 的最佳染料/蛋白質(zhì)比例。

在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

純化偶聯(lián)物

以下方案是使用Sephadex G-25色譜柱進(jìn)行染料-蛋白偶聯(lián)純化的示例。

根據(jù)制造說(shuō)明制備Sephadex G-25色譜柱。

將反應(yīng)混合物（來(lái)自“運(yùn)行共軛反應(yīng)"）加載到 Sephadex G-25 色譜柱的頂部。

一旦樣品在頂部樹脂表面下方運(yùn)行，立即加入 PBS （pH 7.2-7.4）。

向所需樣品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。合并含有所需染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的餾分。注意：為了立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分用于多種用途。注意：為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

  AAT Bioquest qing化物5.5馬來(lái)酰亞胺

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